G-metode for rekombinante plasmider. Rekombinant plasmid, stamme escherichia coli, kimært protein og deres anvendelse. DNA-molekylforskning

mottak rekombinant DNA  under kunstige forhold, og genkloning ble først utført i 1972 av amerikanske forskere Boyer og Cohen.

I denne molekylkonstruksjon utfører plasmid DNA en vektor (dirigerende) funksjon, siden plasmider kan rekombineres til kromosomalt DNA. På grunn av nærværet av antibiotikaresistensgenet i denne ble denne vektorkonstruksjon introdusert i en plasmidfri, dvs. antibakteriell bakteriecelle. Bakterier med rekombinante plasmider, på grunn av det faktum at de har et antibiotikaresistensgen, i motsetning til plasmidfrie bakterier, dør ikke i et næringsmedium som inneholder et antibiotikum. Derfor blir et antibiotikum introdusert i prøverøret og en klon av den rekombinante bakterien isolert, som deretter dyrkes. Hver bakterie som utgjør denne klonen vil inneholde et stykke fremmed (heterologt) DNA, og dette stykket kan formere seg etter hvert som den bakterielle biomassen multipliserer. I tillegg, hvis det rekombinante plasmidet har evnen til autonom replikasjon, kan et stykke fremmed DNA multiplisere flere titalls ganger. Reproduksjon av fremmed DNA ved hjelp av en vektorkonstruksjon kalles kloningsgener.  Som en vektor for kloning av DNA-segmenter, virus- og fag-DNA-molekyler eller

Biotechnology Abstract

"Rekombinante proteiner (egenskaper av plasmider, oppnå)"

Genteknologi er mer spesifikk og mer presis enn celleteknikk med tanke på egenskapene til objektene som brukes og fungerer hovedsakelig med cellefragmenter av forskjellige former og størrelser. Begrepene "genteknologi", "genteknologi" og "rekombinant DNA" er likeverdige.

Genteknologi kan representeres som en kombinasjon av DNA-fragmenter av naturlig og syntetisk opprinnelse eller deres kombinasjon in vitro med den påfølgende introduksjonen av de oppnådde rekombinante strukturer i en levende celle, slik at det innførte DNA-fragmentet enten blir replikert eller autonomt uttrykt etter inkludering i kromosomet.

Suksessen med genteknologi har ført til at over 100 humane proteiner (bioregulatorer, homeostase-korrektorer, medfødte og ervervede immunitetsfaktorer) kan beholde sin videospesifisitet. De produseres som medikamenter ved mikrobiell syntese. Videre tillater rekombinant DNA-teknologi å bli forbedret: øk fysiologisk aktivitet, reduser sannsynligheten for bivirkninger etter administrering, og så videre.

Det viktigste i å oppnå rekombinante proteiner er å løse problemet med råstoffmangel, siden det er umulig å få dem fra menneskelig vev i industriell skala.

Som produsenter av rekombinante humane proteiner brukes de mest brukte i dag: E. coli (E. coli), Bacillus subtilis (hø bacillus), Saccharomyces cerevisiae (bakergjær).

Disse organismer er ganske trygge, men utslipp til miljøet av flere årsaker er uønsket. I denne forbindelse er det aksepterte og nøye overholdte regler for arbeid med rekombinanter.

Sikkerhet må overholdes på genetisk og fysisk nivå, og dette gjelder produksjon av rekombinante proteiner.

1. Genteknologiske metoder for produksjon av rekombinante proteiner

Genteknologi - konstruksjon av in vitro funksjonelle aktive genetiske strukturer (rekombinant DNA), eller på annen måte - å lage kunstige genetiske programmer (Bayev A.A.). Av E.S. Piruzyan genteknologi er et system med eksperimentelle teknikker som tillater laboratoriekonstruksjon (in vitro) av kunstige genetiske strukturer i form av såkalte rekombinante eller hybrid DNA-molekyler.

Genteknologi - få nye kombinasjoner av genetisk materiale gjennom manipulasjoner av nukleinsyremolekyler utenfor cellen og overføring av de skapte genkonstruksjonene til en levende organisme, noe som resulterer i deres inkludering og aktivitet i denne organismen og dens avkom. Vi snakker om rettet, i henhold til et forhåndsbestemt program, design av molekylære genetiske systemer utenfor kroppen med deres påfølgende introduksjon i en levende organisme. I dette tilfellet blir rekombinante DNA en integrert del av det genetiske apparatet til mottakerorganismen og informerer den om nye unike genetiske, biokjemiske og deretter fysiologiske egenskaper.

Hensikten med anvendt genteknologi er å utforme slike rekombinante DNA-molekyler som, når de blir introdusert i det genetiske apparatet, vil gi kroppens egenskaper som er gunstige for mennesker. For eksempel å skaffe “biologiske reaktorer” - mikroorganismer, planter og dyr som produserer stoffer som er farmakologisk betydningsfulle for mennesker, opprettelse av plantesorter og dyre raser med visse attributter som er verdifulle for mennesker. Genteknologiske metoder tillater genetisk sertifisering, diagnostiserer genetiske sykdommer, lager DNA-vaksiner og gjennomfører genterapi av forskjellige sykdommer.

Rekombinant DNA-teknologi bruker følgende metoder:

Spesifikk DNA-spaltning ved restriksjonsnukleaser, akselererer isolering og manipulering av individuelle gener;

Rask sekvensering av alle nukleotider i et renset DNA-fragment, som lar deg bestemme grensene for genet og aminosyresekvensen som er kodet av det;

Konstruksjon av rekombinant DNA;

Hybridisering av nukleinsyrer for å påvise spesifikke RNA- eller DNA-sekvenser med større nøyaktighet og følsomhet basert på deres evne til å binde komplementære nukleinsyresekvenser;

DNA-kloning: in vitro-amplifisering ved bruk av en polymerasekjedereaksjon eller introduksjon av et DNA-fragment i en bakteriecelle som etter en slik transformasjon reproduserer dette fragmentet i millioner av eksemplarer;

Innføring av rekombinant DNA i celler eller organismer.

Konstruksjonen av rekombinante molekyler utføres ved bruk av et antall enzymer - først og fremst restriksjonsenzymer. For tiden brukes over 400 forskjellige restriksjonsenzymer. Disse enzymene syntetiserer et bredt utvalg av mikroorganismer.

Restriksjonsenzymer gjenkjenner og spalter spesifikke nukleotidsekvenser i et dobbeltstrenget DNA-molekyl. Imidlertid er restriksjonsenzymer alene under molekylær kloning ikke nok, siden hydrogenbindingene mellom de fire basene som danner de klebrige ender ikke er så sterke at de holder de to sammenføyede DNA-fragmentene.

Den ene delen av det rekombinante DNA-molekylet bærer det ønskede genet, som antas å være klonet, den andre inneholder den informasjonen som er nødvendig for replikasjon i cellen til det rekombinante DNA.

Den vanligste metoden for genteknologi er metoden for å oppnå rekombinante (som inneholder et fremmed gen) plasmider, som er sirkulære, dobbeltstrengede DNA-molekyler, bestående av flere par nukleotider og som er i stand til å være autonome.

Plasmider er preget av en stabil eksistens i en ikke-kromosom tilstand hos bakterier. Hver bakterie, i tillegg til hoved-DNA-molekylet som ikke forlater cellen (5 * 106 nukleotidpar), kan inneholde flere forskjellige plasmider som den utveksler med andre bakterier.

Plasmider, hvis størrelser varierer fra flere tusen til hundretusener av basepar, og antall kopier per celle - fra ett til flere hundre, er i stand til autonom (uavhengig av hovedkromosom) replikasjon og er arvelig i en rekke cellegenerasjoner.

Selv om mange plasmider gir vertsceller påtagelige selektive fordeler (resistens mot antibiotika, tungmetaller, etc.), er de fleste av dem, det vil si, ikke manifestert i fenotypen til cellene.

Det er ingen overdrivelse å si at bioteknologiens fortid, nåtid og fremtid er basert på det genetiske interspesifikke og intraspesifikke mangfoldet av organismer. En endring i utviklingsnivået for vitenskap bidrar bare til utvidelse og fremvekst av kvalitativt nye måter å bruke dette mangfoldet på.

Dermed førte den intensive utviklingen av grunnleggende forskning innen biologi i andre halvdel av det tjuende århundre til betydelig fremgang på slike områder av biologi som molekylærbiologi og genetikk, biokjemi og enzymologi, nevrofysiologi og biofysikk. Ved å bruke metodikken for de eksakte vitenskaper (fysikk, kjemi, matematikk), la forskere å karakterisere forskjellige vitale prosesser på nivået av intermolekylære interaksjoner. Å dechiffrere strukturen til DNA og RNA, prosessen med å implementere genetisk informasjon har ført til utviklingen av den såkalte DNA-teknologien, som ga forskeren muligheten til å jobbe med individuelle gener - spesifikke seksjoner av genetisk materiale.

Som et resultat dukket det opp et meget effektivt verktøy for den eksperimentelle studien av genetisk materiale: dets organisering, funksjon, interaksjon mellom ulike elementer og evolusjon. For en rekke av de mest genetisk studerte organismer var det mulig å få "tegninger" av deres genom.

Når metodene for å isolere individuelle gener ble utviklet, betingelsene for å opprettholde deres stabilitet ble valgt og mønstrene for genoverføring ble bestemt, var det en reell mulighet for å konstruere rekombinant DNA (opprettelse av rekombinant DNA betyr bokstavelig talt å kombinere (rekombinere) to deler av DNA av forskjellige typer). Faktisk begynte arvelig variasjon å bli dannet målrettet i henhold til en persons vilje og ønske, og organismer ble oppnådd som har en slik kombinasjon av gener (og følgelig trekk) som er fraværende i naturen.

For tiden er genteknologiske metoder - rekombinante DNA-metoder - for mange fagpersoner hjørnesteinen i bioteknologibyggingen.

Bruk av genteknologiske metoder involverer rettet, i henhold til et forhåndsbestemt program, design av molekylære genetiske systemer utenfor kroppen med deres påfølgende introduksjon i en levende organisme.

Å bruke metodikken for genteknologi i det anvendte aspektet innebærer konstruksjon av slike rekombinante DNA-molekyler som, når de ble introdusert i det genetiske apparatet, vil gi kroppens egenskaper som er gunstige for mennesker.

Takket være dette løses mange anvendte problemer: å skaffe “biologiske reaktorer” - mikroorganismer, planter og dyr som produserer proteinpreparater som er farmakologisk betydningsfulle for mennesker, og skaper svært produktive dyraser med visse attributter som er verdifulle for mennesker, avlsplanter som er resistente mot forskjellige patogener og skadedyr, og så videre. på. Genetisk sertifisering, diagnose av genetiske sykdommer, oppretting av DNA-vaksiner og behandling av forskjellige sykdommer er også forbundet med den samme høyteknologien. Dermed var den nåværende gunstige situasjonen innen biologi en kraftig drivkraft i utviklingen av moderne bioteknologi, et veldig viktig område med praktisk anvendelse av resultatene fra grunnleggende vitenskaper.

1. Atanasov A. Bioteknologi i avlingsproduksjon. Novosibirsk: ICGSO RAS, 1993 .-- 241 s.

2. Baranov V.S. Genterapi - medisin fra det XXI århundre // Soros pedagogiske tidsskrift. Nr. 3. 1999. S. 3 - 68.

3. Becker M.E., Liepins G.K., Raipulis E.P. Bioteknologi. M .: Agropromizdat, 1990.334 s.

4. Glebov O.K. Genetisk transformasjon av somatiske celler // Metoder for celledyrking. L .: Vitenskap, 1988.

5. Glick B., Pasternak J. Molekylær bioteknologi. Prinsipper og anvendelse. M .: Mir, 2002.

6. Egorov N.S., Samuilov V.D. Moderne metoder for å lage industrielle stammer av mikroorganismer // Bioteknologi. Vol. 2. M .: Videregående skole, 1988.208 s.

7. Grunnleggende om farmasøytisk bioteknologi: Tekstbok / T.P. Prischep, V.S. Chuchalin, K.L. Zaykov, L.K. Mikhalev. - Rostov-på-Don .: Phoenix; Tomsk: NTL Publishing House, 2006.

8. Piruzyan E.S., Andrianov V.M. Plasmider av agrobakterier og genetisk prosjektering av planter. M .: Nauka, 1985.280 s.

det er flere forskjellige plasmider som det utveksles med andre bakterier.

Plasmider er autonome genetiske elementer som replikerer (det vil si multipliserer) i en bakteriecelle samtidig med hoved-DNA-molekylet. Selv om plasmider bare utgjør en liten brøkdel av cellulært DNA, bærer de gener som medisinresistensgener som er viktige for bakterier. Ulike plasmider inneholder forskjellige gener for resistens mot antibakterielle medisiner.

Plasmidvektorer er som regel skapt av genteknologi, siden naturlige (umodifiserte) plasmider mangler et antall egenskaper som kreves for en vektor av høy kvalitet:

Liten i størrelse, siden effektiviteten til overføring av eksogent DNA til E. coli avtar med en plasmidlengde på mer enn 15 000 nukleotidpar;

Tilstedeværelsen av et restriksjonssted hvor innsetting er gjort;

Tilstedeværelsen av en eller flere selektive genetiske markører for å identifisere mottakerceller som bærer rekombinant DNA.

For å oppnå et rekombinant plasmid spaltes DNA fra en av plasmidene med det valgte restriksjonsenzym. Genet som må introduseres i bakteriecellen spaltes fra DNA fra humane kromosomer ved å bruke et restriksjonsenzym, så dets klebrig ender er komplementære til nukleotidsekvensene i endene av plasmidene.

Enzymet ligase limer begge deler av DNA, noe som resulterer i et rekombinant ringplasmid, som føres inn i bakterien E. coli. Alle etterkommere av denne bakterien (kloner) inneholder et fremmed gen i plasmider. Hele denne prosessen kalles kloning.

Plasmider blir introdusert i somatiske celler ved å bruke kjemikalier som øker permeabiliteten til cellemembranen. Spesielt, for å sikre penetrering av plasmid-DNA i cellene, blir de behandlet med en iskald løsning av kalsiumklorid, og deretter holdt de ved 42 ° C i 1,5 minutter. Denne behandlingen fører til lokal ødeleggelse av celleveggen. Maksimal transformasjonsfrekvens er -10-3, det vil si at for hver tusen celler er det en transformert. Frekvensen av transformasjon er ikke 100%, da brukes seleksjonsskjemaer for å identifisere de transformerte cellene.

Som markører kan plasmidet inneholde gener som bestemmer bakterienes resistens mot antibiotika. Innføring av et fremmed (donor) gen i markørgenet fører til inaktivering av sistnevnte. Dette gjør det mulig å skille mellom transformerte celler som fikk et vektorplasmid (som mistet antibiotikaresistens) og celler som fikk et rekombinant molekyl (som beholdt resistens mot et, men mistet resistens mot et annet antibiotikum). Denne teknikken kalles inaktivering av innsatsmarkøren.

For å velge transformerte celler som inneholder rekombinant DNA (et hybridplasmid), utføres resistensstesting mot spesifikt antibiotika. For eksempel er celler som bærer et hybridplasmid motstandsdyktig mot ampicillin, men er følsomme for tetracyklin (hvor donor-DNA settes inn i markørgenet).

Prosessen med å separere genomisk DNA i klonede elementer og introdusere disse elementene i vertsceller kalles å lage et genomisk bibliotek (klonbank, genbank).

Alle kloningssystemer må oppfylle to grunnleggende krav:

1. tilstedeværelsen av flere steder for kloning;
2. muligheten for en ganske enkel identifisering av celler med rekombinant DNA.

For alle rutinemessige molekylære kloningsprosedyrer blir E. coli mye brukt som vertscelle. Celler som kan absorbere fremmed DNA kalles kompetente; E. coli-kompetansen forbedres ved bruk av spesielle kulturforhold. For å oppnå store mengder fremmede proteiner ved bruk av rekombinante E. coli-stammer, ble et plasmid konstruert inneholdende en sterk promoter, et selektivt markørgen og en kort seksjon med flere unike steder for restriksjonsenzymer polilenker.

Effektive metoder for å transformere E. coli med plasmider er elektroporering (eksponering for cellemembraner med elektrisk strøm for å øke permeabiliteten deres). For introduksjon av klonede gener i somatiske celler, brukes også mikroinjeksjoner og mikropunkter eller fusjon av DNA-belastede membranvesikler (liposomer) med cellen.

konklusjon

Det er ingen overdrivelse å si at bioteknologiens fortid, nåtid og fremtid er basert på det genetiske interspesifikke og intraspesifikke mangfoldet av organismer. En endring i utviklingsnivået for vitenskap bidrar bare til utvidelse og fremvekst av kvalitativt nye måter å bruke dette mangfoldet på.

Dermed førte den intensive utviklingen av grunnleggende forskning innen biologi i andre halvdel av det tjuende århundre til betydelig fremgang på slike områder av biologi som molekylærbiologi og genetikk, biokjemi og enzymologi, nevrofysiologi og biofysikk. Ved å bruke metodikken for de eksakte vitenskaper (fysikk, kjemi, matematikk), la forskere å karakterisere forskjellige vitale prosesser på nivået av intermolekylære interaksjoner. Å dechiffrere strukturen til DNA og RNA, prosessen med å implementere genetisk informasjon har ført til utviklingen av den såkalte DNA-teknologien, som ga forskeren muligheten til å jobbe med individuelle gener - spesifikke deler av genetisk materiale.

Som et resultat dukket det opp et meget effektivt verktøy for den eksperimentelle studien av genetisk materiale: dets organisering, funksjon, interaksjon mellom ulike elementer og evolusjon. For en rekke av de mest genetisk studerte organismer var det mulig å få tak i tegninger av deres genom.

Når metodene for å isolere individuelle gener ble utviklet, betingelsene for å opprettholde deres stabilitet ble valgt og mønstrene for genoverføring ble bestemt, var det en reell mulighet for å konstruere rekombinant DNA (opprettelse av rekombinant DNA betyr bokstavelig talt å kombinere (rekombinere) to deler av DNA av forskjellige typer). Faktisk begynte arvelig variasjon å bli dannet målrettet i henhold til en persons vilje og ønske, og organismer ble oppnådd som har en slik kombinasjon av gener (og følgelig trekk) som er fraværende i naturen.

For tiden er genteknologiske metoder - rekombinante DNA-metoder - for mange fagpersoner hjørnesteinen i bioteknologibyggingen.

Bruk av genteknologiske metoder involverer rettet, i henhold til et forhåndsbestemt program, design av molekylære genetiske systemer utenfor kroppen med deres påfølgende introduksjon i en levende organisme.

Å bruke metodikken for genteknologi i det anvendte aspektet innebærer konstruksjon av slike rekombinante DNA-molekyler som, når de ble introdusert i det genetiske apparatet, vil gi kroppens egenskaper som er gunstige for mennesker.

Takket være dette løses mange anvendte problemer: å skaffe biologiske reaktorer - mikroorganismer, planter og dyr som produserer proteinpreparater som er farmakologisk betydningsfulle for mennesker, og skaper svært produktive dyre raser med visse egenskaper som er verdifulle for mennesker, avlsplanter som er resistente mot forskjellige patogener og skadedyr, og så videre. Genetisk sertifisering, diagnose av genetiske sykdommer, oppretting av DNA-vaksiner og behandling av forskjellige sykdommer er også forbundet med den samme høyteknologien. Dermed var den nåværende gunstige situasjonen innen biologi en kraftig drivkraft i utviklingen av moderne bioteknologi, et veldig viktig område med praktisk anvendelse av resultatene fra grunnleggende vitenskaper.

referanser

1. Atanasov A. Bioteknologi i avlingsproduksjon. Novosibirsk: ICGSO RAS, 1993.241 s.
2. Baranov V.S. Genteterapi medisin fra det 21. århundre // Soros Educational Journal. Nr. 3. 1999 P. 3 68.
3. Becker M.E., Liepins G.K., Raipulis E.P. Biotechnology. M .: Agropromizdat, 1990.334 s.
4. Glebov O.K. Genetisk transformasjon av somatiske celler // Metoder for celledyrking. L .: Vitenskap, 1988.
5. Glick B., Parsnip J. Molecular Biotechnology. Prinsipper og anvendelse. M .: Mir, 2002.
6. Egorov N.S., Samuilov V.D. Moderne metoder for å lage industrielle stammer av mikroorganismer // Bioteknologi. Vol. 2. M .: Videregående skole, 1988.208 s.
7. Grunnleggende om farmasøytisk bioteknologi: Textbook / T.P. Prishchep, V.S. Chuchalin, K.L. Zaikov, L.K. Mikhaleva. Rostov-på-Don .: Phoenix; Tomsk: NTL Publishing House, 2006.
8. Piruzyan E.S., Andrianov V.M. Plasmider av agrobakterier og genteknologi av planter. M .: Nauka, 1985.280 s.

Etabler en samsvar mellom metodene og feltene innen vitenskap og produksjon som disse metodene brukes i: for hver stilling som er gitt i den første kolonnen, velg den tilsvarende posisjonen fra den andre kolonnen.

Skriv ned de valgte tallene i tabellen under de tilsvarende bokstavene.

Forklaring.

Bioteknologi er produksjon av produkter og materialer som er nødvendige for mennesker ved bruk av levende organismer, dyrkede celler og biologiske prosesser.

Valg: oppnå polyploider; avkom test; heterosis. Bioteknologi: celle- og vevskulturmetode; bruk av gjær for produksjon av proteiner og vitaminer; rekombinant plasmidmetode.

Svar: 122211.

bemerkning.

plasmider  - små sirkulære DNA-molekyler som er til stede i bakterieceller. De inneholder tilleggsgenetisk informasjon, er i stand til autonomt, uavhengig av kromosom-DNA, replikere; noen plasmider har evnen til å integrere seg i og forlate bakteriekromosomet; noen kan flytte fra en celle til en annen. I genteknologi brukes tre typer plasmider F, P og Col mest. Metoden for å lage rekombinante plasmider ble utviklet av P. Berg i 1972. De skapte et rekombinant plasmid som inneholdt galaktoseoperon E. coli. Naturlige eller syntetiserte gener kan inkluderes i plasmidet. Etter penetrering i bakteriecellen kan det rekombinante plasmid fungere og multiplisere autonomt, eller bli inkludert i DNAet til bakteriekromosomet. Ved å bruke denne metoden ble menneskelige gener introdusert i bakterieceller og stammer av somatostatin, interferon, insulin, superprodusentbakterier, humane veksthormoner, storfe, dyr og humant globin ble opprettet.

Utviklingen av bioteknologi for produksjon av interferon er en kompleks prosess som krever streng regulering av handlinger i flere stadier. Vurder å få interferon med rekombinant DNA-teknologi. Et rekombinant DNA-molekyl oppnås ved å sette visse gener inn i DNA. Ved hjelp av enzym-restriksjonsenzymer "kutter" deler av det opprinnelige DNAet og utskiller de nødvendige gener. Et annet enzym - ligase - "syr" gener i nytt DNA. Når de dyrkes produserer mikroorganismer med rekombinant DNA det ønskede produktet.

Opprinnelig blir leukocytt-suspensjonen som er isolert fra blodet fra givere og er i kultur behandlet med et virus som har en induserende effekt på biosyntesen av interferon. Deretter blir mRNA fremstilt fra leukocytter som programmerer biosyntesen av interferon. Selv i Sendai-virusinduserte leukocytter inneholder mRNA ikke mer enn 0,1% (Smorodintsev A.A., 1985).

Ved å bruke det polynukleotidbaserte mRNA omvendt transkriptaseenzym (revertase) syntetiseres en enkeltstrenget DNA-kopi (cDNA) som er komplementær til det. Dette trinnet er forut for syntese av deoksyribonukleotid, et frø bestående av 32 mononukleotider, som, når de hybridiseres, interagerer med den tilsvarende komplementære regionen av mRNA isolert fra leukocytter og deretter fungerer som et utgangspunkt fra hvilken RNA-avhengig syntese av en av DNA-kjedene (cDNA) begynner.

På neste trinn blir biosyntesen av den andre komplementære DNA-strengen utført på den enstrengede cDNA separert fra hybrid DNA - RNA-strukturen. For å sikre komplementariteten til klissete ender i det syntetiserte DNA, er koblinger (adaptere) festet til dem. De er kjemisk syntetiserte korte seksjoner av DNA med forskjellige klissete ender. Reav endene av cDNA, så vel som det valgte vektorplasmidet. Som, som et resultat av enzymatisk hydrolyse, spaltes av et restriksjonsenzym for å danne et lineært DNA-molekyl med klebrig ender, gjør at cDNA kan kobles til plasmidet og, takket være de klebrige ender og DNA-ligase, for å danne et ringformet rekombinant plasmid med syntetisert cDNA, der genet som koder for en interferon lokalisert biosyn.

Deretter må det rekombinante plasmidet innføres i bakteriecellen. Neste trinn er letingen etter en bakteriecelle som inneholder interferongenet. Ved et slikt trekk som evnen til å hybridisere, identifiseres bakterier som inneholder rekombinante plasmider med et gen som koder for interferonsyntese inkludert i dem. Disse rekombinante plasmider isoleres fra bakterier, og interferongener oppnås ved å bruke restriksjonsenzymer. Et eukaryotisk interferongen i en bakteriecelle koder for syntesen av "rå" interferon, for konvertering av hvilket modent interferon i eukaryote celler ikke har de nødvendige betingelser. For å overvinne denne hindringen omorganiseres det eukaryote genet in vitro ved å fjerne de tilsvarende nukleotider som koder for informasjon som ikke er en del av det funksjonelle interferonmolekylet ved passende restriksjonsenzym. I løpet av begrensningsreaksjonen oppnås dessuten "busting". Samtidig blir tripletten som koder for syntesen av den første aminosyren i interferon-polypeptidkjeden, slettet. Dette, så vel som den initierende biosyntese av polypeptidkjeden som går foran den, blir kodoner syntetisert kjemisk og festet til interferongenet. Genet som er opprettet som et resultat av komplekse manipulasjoner blir overført til plasmidet, hvor det kombineres med bakteriepromotoren, og deretter introdusert i bakteriell vertscelle. På en så kompleks flertrinns måte ble E. coli produsentstammen opprettet. I 1 liter av en bakteriesuspensjon som inneholder omtrent 1011 celler, når konsentrasjonen av a-interferon 5 mg, som er 5000 ganger mer enn mengden som kan oppnås fra 1 liter donert blod.

9384 0

DNA-molekylforskning

Rekombinant DNA inneholder et gen (eller gener) og en vektor. En vektor er et DNA-fragment som sikrer forplantning av hybrid DNA og syntese av sluttprodukter av det genetiske systemet - proteiner. Hovedstudiene ble utført på bakterier og virus, da de er en av de enkleste organismer, ellers kalles de "vertsceller". Rekombinant DNA-teknologi lar deg få genmodifiserte varianter på en målrettet og strengt kontrollert måte.

Hvordan kan gener fra høyere organismer introduseres i bakterieceller? Den vanligste metoden for genteknologi er metoden for å oppnå rekombinante DNA, dvs. plasmider som inneholder et fremmed gen. Plasmider er sirkulære dobbeltstrengede DNA-molekyler som består av flere tusen par nukleotider. Hver bakterie, i tillegg til hoved-DNA-molekylet som ikke forlater cellen (5106 nukleotidpar), kan inneholde flere forskjellige plasmider som den utveksler med andre bakterier.

Plasmider er autonom genetisk replikering (dvs. multipliserer) i en bakteriecelle på samme tid som hoved-DNA-molekylet. Selv om plasmider bare utgjør en liten brøkdel av cellulært DNA, er det de som bærer så viktige gener for bakterier som legemiddelresistensgener. Ulike plasmider inneholder forskjellige gener for resistens mot antibakterielle medisiner. Enkelheten med arrangementet av plasmider og enkelheten de "kommer inn" og "ut" fra bakteriene brukes av genetiske ingeniører for å introdusere gener fra høyere organismer i bakterieceller.

Et kraftig verktøy innen genteknologi oppdages i 1974 enzymer - restriksjon endonukleaser, eller restriksjonsenzymer.

Begrensning betyr bokstavelig talt "begrensning." Bakterier i cellen produserer restriktaseenzymer for å ødelegge fremmed (primært fag-DNA), noe som er nødvendig for å begrense virusinfeksjon. Restriksjonsenzymer "gjenkjenner" visse nukleotidsekvenser i DNA (de såkalte nettstedene - gjenkjennelsessteder) og introduserer symmetriske brudd i DNA-kjeder i like avstander fra sentrum av stedet. Som et resultat dannes korte enkeltrådede "haler", kalt "klissete ender", ved endene av hvert fragment av begrenset DNA.

Omtrent fem hundre forskjellige restriksjonsenzymer ble isolert fra forskjellige typer bakterier, for hvilke restriksjonsseter ble beskrevet.

Genetikk

Hele prosessen med å få slike bakterier kalles kloning. Det består av påfølgende trinn (fig. 3.3):
   1. Begrensning - kutting av humant DNA med et restriksjonsenzym i mange forskjellige fragmenter, men med de samme "klissete" endene. De samme endene oppnås ved å kutte plasmid-DNA med det samme restriksjonsenzym.

   Fig. 3.3. Innføring av et gen i plasmidet Escherichia coli og kloning av dette genet i E. coli-celler
   Plasmid E. coli spaltes av en restriksjonsendonuklease i en spesifikk region i begge DNA-strengene, slik at korte uparede deoksyribonukleotidsekvenser (TTAA eller AATT) er lokalisert i endene av det spaltede plasmidet, dvs. fire nukleotider hvor basene er representert av timin og adenin.
   Genet som skal settes inn i plasmidet spaltes med den samme restriktase, slik at endene er komplementære til nukleotidsekvensene i endene av plasmidet (AATT og TTAA).
   Både DNA (gen og plasmid) er tverrbundet ved bruk av ligase. Deretter blir det rekombinante plasmidet introdusert i E.coH-cellen, som når multiplisert danner en klon, hvor alle celler inneholder det rekombinante plasmidet, og derfor det fremmede genet. Sistnevnte er nå klonet i cellene til E. coli og induserer syntesen av et spesifikt protein i det.

3. Transformasjoner - innføring av rekombinante plasmider i bakterieceller behandlet på en spesiell måte - slik at de blir gjennomtrengelige for makromolekyler i løpet av kort tid. Plasmider trenger imidlertid bare en del av de behandlede bakteriene. De skilles ut ved hjelp av et spesifikt næringsmedium (for eksempel en antibiotikaløsning). Hver av de transformerte bakteriene formerer seg og danner en koloni med mange tusen etterkommere - en klon.

4. Screening - utvalg blant kloner av transformerte bakterier som beholder plasmider som bærer det humane genet.

Det er ikke alltid mulig å kutte det ønskede genet nøyaktig ved å bruke restriksjonsenzymer. Mange gener spaltes av disse enzymene i flere deler eller inneholder ikke sekvenser gjenkjent av restriktaseenzymer. I noen tilfeller begynner derfor kloningsprosessen ikke med å kutte tilfeldige DNA-fragmenter fra kromosomer, men med målrettet å oppnå det ønskede genet.

For å gjøre dette, er i-RNA, som er en transkripsjonskopi av dette genet, isolert fra humane celler, og ved hjelp av et enzym - revers transkriptase (revertase) - blir en komplementær DNA-streng syntetisert, hvoretter i-RNA, som fungerer som en matrise for DNA-syntese, blir ødelagt av RNAase - et spesielt enzym som kan hydrolysere RNA-kjeden. Den gjenværende DNA-strengen tjener som en mal for revers transkriptasesyntese (DNA-polymerase) komplementær til den andre DNA-strengen.

Den resulterende doble heliksen av DNA kalles k-DNA (komplementært DNA), det tilsvarer genet som i-RNA ble lest fra. Slikt c-DNA settes inn i et plasmid som transformerer bakterier, og kloner som inneholder bare utvalgte humane gener oppnås.

LV Timoshchenko, M.V. Chubik